【干貨】實驗室消毒和滅菌基礎(chǔ)知識-實驗員務(wù)必收藏

消毒和滅菌是微生物實驗技術(shù)中最基本的操作技術(shù)，因此從事藥品生產(chǎn)、檢驗的人員均應(yīng)了解消毒和滅菌的基本概念，各自的應(yīng)用方法及其意義，操作時應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)的操作規(guī)程，一方面確保生產(chǎn)與檢驗工作的效果，另一方面也是對自身安全的保護(hù)。

消毒和滅菌的概念

1、消毒：指對病原微生物的繁殖體的致死作用，但不能殺死芽孢等全部微生物，因此消毒是不徹底的，不能代替滅菌。凡用于消毒的化學(xué)藥品稱為消毒劑，因此人們也常稱消毒劑為化學(xué)消毒劑。

2、滅菌：殺滅物體中所有活的微生物（含芽孢）的作用，滅菌是采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。通常用物理方法來達(dá)到滅菌的目的。

消毒滅菌方法

目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學(xué)方法(消毒劑、抗生素)兩大類。

1.干熱滅菌法
干熱滅菌法是利用恒溫干燥箱內(nèi)120ºC~150ºC的高熱，并保持90~120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法。

主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。

用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。

酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌的方法之一。在進(jìn)行動物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時，常須利用工作臺面上的酒精燈火焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。 

2.濕熱滅菌法

壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前最常用的一種滅菌方法。

它利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡。

適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和某些培養(yǎng)液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.0～1.1kg/cm²，維持20～30min即可達(dá)到滅菌效果。

3.射線滅菌法

利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法。

紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作用而使其滅活。

適合于實驗室空氣、地面、操作臺面滅菌。滅菌時間為30min。用紫外線殺菌時應(yīng)注意，不能邊照射邊進(jìn)行實驗操作，因為紫外線不僅對人體皮膚有傷害，而且對培養(yǎng)物及一些試劑等也會產(chǎn)生不良影響。

4.過濾除菌法

過濾除菌法是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。

過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養(yǎng)液等。

目前，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.22～0.45μm范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜，溶液通過濾膜后，細(xì)菌和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過。

5.化學(xué)消毒劑消毒法

化學(xué)消毒劑消毒法用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、某些實驗器皿等。

1）消毒劑分類

依殺滅微生物能力進(jìn)行分類，有以下三種：

2）消毒劑的選擇

消毒劑的種類很多，性質(zhì)不一，因此應(yīng)根據(jù)實際需求選擇既安全又有效的消毒劑。在選擇時至少應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：

3）消毒劑的使用

A、影響消毒效果的因素

影響消毒劑效能的因素比較復(fù)雜，一般都因消毒劑的種類而異，因此各種消毒劑使用時應(yīng)注意以下因素

a）微生物種類及數(shù)量

消毒劑的有效濃度及作用時間因微生物的種類及數(shù)量的不同而有差異，不同類型的病原微生物對消毒劑的抗力不同。對于細(xì)菌繁殖體來說，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌對消毒劑的耐受性強(qiáng)，尤其是銅綠假單胞菌的耐受性較強(qiáng)；芽孢的耐受力最強(qiáng)，在化學(xué)消毒劑中，戊二醛和過氧乙酸可殺滅芽孢，但其作用力不如熱力滅菌方法；病毒對消毒因子的耐力也因其種類的不同而有相當(dāng)大的差異，親水病毒的耐力較親脂病毒要強(qiáng)；真菌對大多數(shù)化學(xué)藥物的耐受力較強(qiáng)，因此適用于細(xì)菌的消毒劑并不一定適用于真菌，但真菌一般耐熱性較差。微生物污染數(shù)量多時，應(yīng)加長消毒接觸時間、加大消毒劑用量或提高消毒劑濃度。

b）溫度

一般來說，消毒的速度隨溫度的提高而加快，其殺菌作用也相應(yīng)增強(qiáng)。溫度影響的原理是其可影響菌體表面和酶系統(tǒng)的活性，以及消毒劑的分子運(yùn)動，使得消毒劑與菌細(xì)胞接觸的機(jī)會增加，從而使消毒的時間縮短。但溫度的變化對各種消毒劑的影響不同，如醇類和酚類一般受溫度影響較小，但如甲醛、環(huán)氧乙烷等溫度升高一倍時，其殺菌效果可增加十倍。

c）濃度

消毒劑的濃度應(yīng)考慮的是其主要成分的濃度，根據(jù)不同類型的消毒劑性質(zhì)，提高或降低濃度，均可顯著影響消毒效果。一般降低消毒劑的濃度需延長相應(yīng)的消毒時間，且消毒劑內(nèi)的有效成分在其保存期內(nèi)也會相應(yīng)下降。

d）pH值

酸堿度常影響酸性或堿性消毒劑的電離度，改變其溶解度及分子結(jié)構(gòu)，影響不同離子型消毒劑的作用，在堿性環(huán)境中，細(xì)菌表面負(fù)電荷增多，陽離子型消毒劑作用較強(qiáng)，在酸性環(huán)境中，細(xì)菌表面負(fù)電荷減少，陰離子型消毒劑的殺菌效果較好；另外pH的過高或過低對微生物的生長及表面物理化學(xué)狀態(tài)均有影響。

e）有機(jī)物質(zhì)

消毒環(huán)境中存在有機(jī)物，則其可在微生物表面形成保護(hù)層阻礙消毒劑與微生物的接觸或延遲消毒劑的作用，可能導(dǎo)致微生物逐漸產(chǎn)生對藥物的適應(yīng)性，這些情況均會不同程度的降低消毒劑的消毒作用，如有機(jī)物可中和一部分消毒劑，有機(jī)物和消毒劑作用，形成溶解度比原來更低或殺菌作用比原來更弱的化合物。一般來說消毒劑中的重金屬類及表面活化劑等受有機(jī)物的影響較大。

B、其他注意點(diǎn)

a）微生物對消毒劑的耐受性

一般來說，為了避免微生物對消毒劑的耐受性，很多企業(yè)的消毒劑是輪換使用的，現(xiàn)今在學(xué)術(shù)界對于消毒劑的輪換使用的必要性尚存爭議，但FDA的監(jiān)管引文中主導(dǎo)應(yīng)進(jìn)行消毒劑輪換，但消毒劑的輪換使用周期應(yīng)以歷史環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)制訂。微生物對消毒劑的耐受性較抗生素要低一些，因為消毒劑比抗生素有更強(qiáng)的殺菌作用。另外使用高濃度的消毒劑來殺滅少量的微生物通常影響不大，因此應(yīng)考慮選擇合適的消毒劑來對抗不斷增強(qiáng)的耐受性。同時建議定期進(jìn)行試驗證明或評估從環(huán)境菌監(jiān)測中分離出的微生物（含已知及新的類型）對該環(huán)境使用消毒劑的敏感性。

b）規(guī)范及安全使用

在消毒劑的使用過程中，人員培訓(xùn)及是否規(guī)范及安全使用該消毒劑對其應(yīng)用有很大影響。接觸消毒劑的人員要求進(jìn)行微生物、清潔滅菌操作、消毒劑的制備/使用/安全處理廢棄稀釋及濃縮消毒劑的培訓(xùn)。如正確配制消毒劑是關(guān)鍵，很多消毒效果不佳或失敗的例子源于消毒劑的過度稀釋，另外用于無菌操作流程的消毒劑必須用無菌水稀釋，一般稀釋用水推薦純化水及更高級別的水，因為水的硬度會影響一些消毒劑的功效。另外在處理可能產(chǎn)生有毒刺激性氣體、腐蝕性較強(qiáng)及濃度較大的消毒劑（如殺孢子劑）時，應(yīng)配備適宜的安全防護(hù)裝備，如安全眼鏡、面罩、過濾氣味的口罩、手套、防護(hù)服等。在消毒劑的使用同時應(yīng)考慮清潔劑的配合使用，清潔是去除表面顆粒及微生物、去除殘留并提高后續(xù)消毒效果，因此清潔是為后續(xù)的消毒做好準(zhǔn)備，同時規(guī)避前后2種輪換消毒劑的互相作用。

6.抗生素抑菌法

抗生素抑菌法主要用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生物污染不嚴(yán)重時的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。

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